ibidi血管生成、侵袭等实验现象

卡西波肉瘤是一种发生在包括口腔在内的多种组织内的，具有*的血管生成能力和侵袭能力的恶性肿瘤。卡西波肉瘤KS已经被鉴定出多种细胞标记物，但是其来源依然是一个迷。美国的科学家之前发现卡西波肉瘤相关的疱疹病毒（KSHV）能够使大鼠的原代间充质干细胞（MSCs）感染，变形，并且重新编辑，使其分化为类卡西波肉瘤细胞。在这次的实验中，科研人员使用KSHV感染由多种组织来源的人原代间充质干细胞，包括骨髓（MSCbm），脂肪组织（MSCa），牙髓，牙龈组织（GMSC），和乳牙。科研人员成功的建立起来KSHV感染的MSCa，MSCbm和GMSC（LTC-KMSCs）的稳定株。其中，这些细胞表达了混合的KS标记物，并且显现出不同的血管生成、侵袭和变形的现象，而LTC-KMSCs表现出比未感染细胞更低的增殖率。进而研究人员发现KSHV介导的血管生成是通过KSHV介导的microRNA激活了AKT通路。这些研究说明，在人体内MSCs是KSHV的靶细胞，会建立起多种KSHV感染的模型。

研究人员采用各种MSCs，铺在基质胶上，孵育8小时，对比不同细胞的分枝数和节点数。

Thyroid Transcription Factor 1 Reprograms Angiogenic Activities of Secretome

L. Wood, N. Cox, C. Phelps, S. Lai, A. Poddar, C. Talbot and D. Mu

Scientific Reports, 2016, 10.1038/srep19857

（一）实验材料和实验方法

1）细胞：  MSCs     ScienCell Research Laboratories (Carlsbad, CA) or Lifeline Cell Technology (Frederick, MD)

2）培养基：      MSC medium         (MSCM; ScienCell Research Laboratories)

3）基质胶：    Matrigel Basement membrane       (BD)    10 µl per well

4）耗材：    ibidi血管生成载玻片  (ibidi, 81506)

5）其他：        细格纸                                  

（二）实验步骤

1）准备基质胶

①　将10μl的Basement membrane以5mg/ml的浓度铺入ibidi血管生成载玻片的内孔中，注意枪头要垂直于内孔的正上方加入Matrigel，防止有Matrigel流经上孔而留下残留胶。

②　盖上ibidi血管生成载玻片的盖子。

③　准备一个10cm的培养皿，放入浸过水的纸巾，制成一个湿盒。

④　将ibidi血管生成载玻片放入培养皿中，盖上培养皿盖。

⑤　37℃至少孵育30分钟，使基质胶固化。

怎么知道加了合适体积的Matrigel：

由于Matrigel流动性不强，并且有可能移液枪不准确，有可能10μl的胶不能填满ibidi血管生成载玻片的下孔，这样，必然会影响到实验的成像结果。这时用一张格子纸就能知道移液枪调整到多少能正好把下孔填满。

如上图所示，垂直透过每个孔看下面的格子纸，如果格子被缩小了，那么就说明胶没加满，格子被放大了，那么胶就加多了，格子没发生什么变形，这才是刚刚加满下孔的状态。

3）铺细胞

①　每孔种10000个细胞即可。准备密度为2*105cells/ml的细胞悬液，充分混匀。

②　将胶已经凝固的ibidi血管生成载玻片从湿盒中取出。

③　每孔加入50μl的细胞悬液，注意保持枪头垂直在上孔的上方，不要接触下孔的凝胶。可以使用排枪。

④　同样用格子纸查看是不是加了足够量的液体，如果没有，加入无细胞的培养基，使上孔液体正好加满。

⑤　盖上盖，静置，一段时间后，所有细胞都会沉下去落在Matrigel的表面。

4）采集图像并统计结果

37度 5% CO2孵育8小时后，使用尼康Eclipse E400荧光显微镜采集图像，并其分枝数和节点数进行测量和统计。

三）实验结果

对比LTC-KMSCs几种细胞的成管效果。Mock是未被病毒感染的间充质干细胞，KSHV会增强血管形成效果。图像是铺细胞后8小时采集，100倍放大倍数。

1. 为了研究KSHV相关的miRNA的作用，对比了未被感染MSCs（Mock），感染的MSCs（KSHV）和用10个pre-miRNA簇缺失的突变病毒感染的MSCs（ΔmiR）和用这一突变的KSHV稳转的MSCs（ΔmiR Vector）；以及用逆转录病毒重新表达这10个miRNA簇（ΔmiR Cluster）这几组细胞的血管生成。发现这几个miRNA对于细胞的血管形成有着非常重要的作用。(B) LY294002一种磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）的抑制剂，对于LTC-KMSCa血管形成有明显的抑制作用。并且随着LY294002浓度的上升，抑制作用会增强。两组结果均是铺细胞8小时后以100倍放大倍数采集图像。