ibidiµ-Slide2Well共培养实验方案|共培养延时显微观察斑马鱼幼虫

　　ibidiµ-Slide2Well共培养实验方案，实验描述了将斑马鱼幼虫嵌入低百分比低熔点琼脂糖进行延时显微镜观察的过程。

　　2.共培养实验设备　　

　　(ibidi, 81806)

　　• 热混合器 (例如，Eppendorf，ThermoMixer C)

　　• µ-Slide 2孔共培养载玻片，ibiTreat底部处理 (ibidi, 81806)

　　• 塑料移液管

　　• 可选： 小刷子

　　• 显微镜

　　3.实验步骤

　　实验准备工作：

　　在开始实验之前，按照“缓冲液和溶液"部分的描述准备LMPA。保持在35°C，直到需要使用。如果琼脂已经提前准备好，可以在热混合器中重新加热 (~80°C)，然后让琼脂冷却 (~35°C)。

　　装载：　

　　在我们小组的某些实验中，对斑马鱼脊髓进行了机械性损伤。如果这样做，建议请在装载前让幼鱼恢复至少30分钟。在脊髓横切后，嵌入琼脂的初始存活率为80%。这些幼鱼在琼脂中观察48小时后也都存活了。未受伤的幼鱼的初始存活率接近100%。

　　1. 使用三氯-甲-烷使用溶液麻醉斑马鱼幼鱼2分钟。

　　2. 使用塑料移液管在µ-Slide 2孔共培养载玻片的每个孔中放置一只幼鱼，并使用一些多余的鱼水。

　　3. 对每只幼鱼单独执行以下步骤（以避免变干）：

　　3.1. 使用塑料移液管除去所有鱼水。

　　3.2. 向小孔中加入50µl LMPA，以覆盖幼鱼。

　　3.3. 使用刷子或小的移液管头将幼鱼定位到适当的位置（侧面位置，尽可能水平和直立，具有统一的对准，即始终向左，卵黄在底部）。

　　4. 让LMPA凝胶固化（0.5%凝胶约需20-30分钟）。

　　5. 可选：用包含80mg / L三氯-甲-烷库存溶液的1x鱼水覆盖固化的LMPA凝胶，以进行连续成像的麻醉。

　　6. 用自带的盖子盖住µ-Slide 2孔共培养载玻片，以避免蒸发。

　　7. 斑马鱼幼鱼已经上样好准备成像

　　在48小时的成像期间，如果盖子紧闭，则无需在琼脂上方加入鱼水，因为标本不会变干。这也使得可以进行正置显微镜观察，而不必担心洒出来。　　

图1：斑马鱼幼虫嵌入LMPA中的µ-Slide 2孔共培养器

　　延时显微镜观察：

　　这种样品制备方法被用于连续延时显微镜，以及使用德累斯顿技术大学CRTD的核心设施——光学显微镜设施的各种显微镜在不同时间点拍摄某些视场的快照。 这包括倒置和正置，广角和共聚焦显微镜。　　

图2：A）斑马鱼幼虫受精后72小时，埋入琼脂3小时后的整个µ-Slide 2孔共培养器的亮场瓦片扫描，共有18条幼鱼