ibidi腔室载玻片|揭示钙成像细胞信号转导的奥妙！

　　细胞内的钙称为细胞内钙，可受到高度调节；这种紧密的调节使细胞内钙成为了解细胞功能和信号动力学的较佳的工具，使其能够在细胞迁移、交流和对刺激物或异物作出反应的能力。

　　钙：细胞过程的多功能指示剂

　　钙信号可作为读数来了解病毒在感染过程中利用宿主信号反应的能力，并剖析所涉及的信号通路。有几种细胞内钙的荧光指示剂是可用于研究细胞功能；能够检查伤口愈合、传染病、药物治疗等过程中的细胞反应。为此可利用含有荧光钙指示剂的细胞的活细胞成像，其中荧光的增加表明细胞内钙的增加。

　　钙指示剂的种类及其应用

　　钙指示剂主要分为两大类：化学指示剂和基因编码的钙指示剂。可用于活细胞成像实验的钙指示剂类型取决于预期的细胞系、成像长度以及定性或定量数据的预期结果等因素。

　　1.预期细胞系：

　　对于原代细胞系直接的方法是使用荧光染料，将荧光钙指示剂简单地添加到培养的细胞中，并在孵育期后成像。

　　与基因编码的钙指示剂相比，荧光染料通常更亮、更稳定。在活细胞成像中，荧光染料可以有效地进行短期活细胞成像，但随着时间的推移细胞有排出染料的趋势。钙染料的一个重要考虑因素是使用抑制剂还是激动剂。抑制剂和激动剂也可能影响钙染料反映，类似于在天然组织中的表达。

　　在广泛的钙信号传导实验中，已建立的细胞系是可以被转导以表达遗传编码的钙指示剂，如GCaMP、黄色cameleon等。对现有的不同基因编码钙指示剂进行改进，使指示剂更亮，光稳定性更好，动态范围更大，从而提高了钙的敏感性。慢病毒转导是细胞系中使用的一种较佳的工具，它将允许您选择的指示剂在细胞系中稳定表达。基因编码报告系统的一个潜在问题是，并非所有细胞系都容易被转导。　　

　　在用ADP 进行激动剂治疗期间，人肠道类器官单层的实时、短期成像。这些有机体单层以绿色表达钙指示剂 GCaMP6s。ADP 是一种已知的激动剂，用于在细胞中引发细胞内钙信号传导。激动剂治疗是测试治疗剂量反应的较的好方法。

　　2.成像长度

　　对于活细胞成像，时间长度和间隔是需要记住的重要参数。细胞成像过程中的主要关注的是光漂白和光毒性。应避免持续使用激发光，重要的是选择足够强的曝光时间和光功率，以检测钙信号，但不要过强，以免对细胞造成损害。成像的长度将取决于实验。对于测试激动剂或细胞反应，这通常是5-20分钟的较短成像运行，每1-2秒捕获一次图像。对于研究伤口修复或病毒感染期间钙信号传导的实验，我们会在18-20小时内成像，每分钟捕捉一次图像。　　

　　活细胞成像的技巧

　　考虑要使用的细胞系是很重要的。为了研究钙动力学，使用形成单层的细胞系将确保感兴趣的区域保持聚焦，以捕捉信号动力学，从而获得较佳质量的视频和清晰的量化。对于涉及细胞间通讯和钙动力学的实验，细胞系融合也是一个重要的考虑因素。为了获得质量的图像，选择合适的载玻片非常重要。有些细胞培养物更喜欢玻璃载玻片而不是光学级塑料载玻片，因此最好测试腔室载玻片。我们的细胞系使用ibiTreat μ-Slide 8 Well high八孔高壁腔室载玻片。　　

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　　活细胞成像是使细胞的密度允许形成一个融合的单层，但不会导致细胞过度拥挤和团块。在成像过程中需要使用合适的培养基。许多传统的细胞培养基含有酚红，它可引起高背景荧光。这使得在成像过程中很难从背景噪声中分离出真实信号。因此，重要的是用PBS洗涤细胞，并用无酚红培养基或市售的用于活细胞成像的培养基代替培养基。