µ-Slide趋化载玻片|HUVEC的3D免疫荧光染色细胞趋化实验

　　在趋化性细胞迁移后，可通过免疫细胞化学染色研究定向细胞迁移的形态学特征。ibidi µ-Slide Chemotaxis细胞趋化载玻片可对嵌入的HUVEC（人脐静脉内皮细胞）进行免疫荧光染色的详细实验方案。

µ-Slide 细胞趋化载玻片

　　一、实验材料准备：

　　二、实验步骤：

　　将人脐静脉内皮细胞接种在百分之五十的Matrigel®中，并填充至细胞趋化载玻片中，然后将其沿百分之十的FCS梯度迁移二十四个小时。采用免疫染色法观察内皮细胞在Matrigel®中定向迁移后的形态学特征。人脐静脉内皮细胞的染色是直接在µ-Slide细胞趋化载玻片中进行的。

　　1) 从一边储液池中取出塞子，然后吸出培养基。在抽吸和冲洗步骤中，将塞子留在中央通道中。

　　2) 用1x PBS洗涤

　　3) 用百分之四的多聚甲醛固定细胞和基质蛋白

　　4) 重复实验操作过程2的步骤

　　5) 用百分之零点二的riton X-100 / PBS透化细胞

　　6)  继续重复实验操作过程2的步骤

　　7) 用百分之一的BSA/PBS阻断非特异性抗原→过夜

　　8) 继续重复实验操作过程2的步骤

　　9) 添加一抗：单克隆抗VE钙黏着蛋白，小鼠在四摄氏度下1x 24小时

　　10) 继续重复实验操作过程2的步骤

　　11) 添加二抗：山羊抗小鼠IgG，Alexa Fluor 680→在四摄氏度下过夜

　　12) 继续重复实验操作过程2的步骤

　　13) 加入染色混合物

　　i) 罗丹明phalloidin染色肌动蛋白丝

　　ii) Hoechst 33342对细胞核染色

　　14) 继续重复实验操作过程2的步骤

　　15) 将最后的PBS留在储液罐中并开始成像。

　　免疫荧光图像是由共聚焦激光扫描显微镜获得，配以水物镜。

　　重要提示：与标准染色方案相比，洗涤和染色步骤所需的培养时间更长。这是为了确保抗体通过凝胶充分扩散。

　　三、细胞样品实验结果：

　　人脐静脉内皮细胞在Matrigel®基质中的免疫染色显示，相邻的细胞组优先形成细胞簇并作为集合体迁移。少数细胞呈单细胞迁移。　　

　　图中显示人脐静脉内皮细胞在百分之五十的Matrigel®中的多细胞趋化性的细胞簇。固定后，对细胞进行细胞核蓝色、F-肌动蛋白红色和VE钙粘蛋白青色等进行染色。白色箭头表示VE介导的细胞-细胞接触。

　　当细胞作为个体迁移时，细胞体被拉长，呈间充质梭形。细胞呈前后极性，前缘呈小片状，向梯度方向有突起。当以多细胞单元组织时，细胞团簇表现出明显的前后不对称的群极化。在这里，一个或几个前导细胞参与了前缘的形成，前缘表现出细长的突起或宽的片层。迁移复合体较深区域的连续细胞没有极化。然而，这些细胞特征性地保留了VE钙粘蛋白介导的细胞-细胞接触。