如何利用µ-Slide Y通道培养载玻片优化HUVEC流体培养？

　　ibidi µ-Slide y-shaped通道载玻片是研究内皮细胞对剪切应力反应的强大工具。此次实验应用说明提供了一种简化的方案：在µ-Slide y-shaped中培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC），施加受控的剪切应力，并进行免疫荧光染色。在本示例中，我们用Cy5®对HUVEC上的von-Willebrand-Factor因子进行染色，用Alexa Fluor 488®对分化分子簇31进行间接染色，并用DAPI对细胞核进行复染。

　　该方案主要包含四个步骤：培养→固定→染色→成像

　　1. 培养

　　• 无菌条件下，打开Y通道培养载玻片80126置于80003载玻片支架，通道内注入200μl HUVEC细胞悬液，移除储液池液体。

　　• 用随附的盖子盖住储液池口

　　• 将载玻片和载玻片支架架放入培养箱中，让细胞贴壁。之后，向两个液池中各加入60µl无细胞培养基

　　• 继续培养≥3小时/过夜

　　• 连接ibidi Pump System泵系统（含灌注套件+流体单元+气压泵），在培养箱中进行流动培养。

　　• 使用11ml培养基时，需在3天内更换6ml培养基。

ibidi Pump System泵系统

　　2. 固定、透化和封闭

　　• 使用细胞培养吸液器吸除所有储液池中的培养基。缓慢向一侧储液池中加入1000µl杜氏磷酸盐缓冲液，同时从对侧的储液池中吸出液体，以此洗涤细胞。

　　• 用约150µl含2%多聚甲醛的PBS固定细胞。20分钟后，向一侧储液池中加入约150µl含0.1% Triton® X-100（Fluka）的PBS，同时从对侧的储液池中吸出通道内的液体！确保通道始终保持湿润！

　　• 按照上述方法，用1000µl含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS洗涤细胞。

　　3. 染色和封片

　　• 预先配制好抗体溶液

　　• 将200µl含DAPI的PBS和1% BSA加入通道中，在室温下孵育30分钟

　　• 按照上述方法，用1000µl含1% BSA的PBS洗涤细胞两次

　　• 将200µl含抗vWF（兔源）的PBS和1% BSA加入通道中，在室温下孵育45分钟

　　• 按照上述方法，用1000µl含1% BSA的PBS洗涤细胞两次

　　• 将200µl含抗CD31（鼠源）的PBS和1% BSA加入通道中，在室温下孵育45分钟

　　• 按照上述方法，用1000µl含1% BSA的PBS洗涤细胞两次

　　• 加入200µl 抗鼠（鸡源）Alexa Fluor® 488，在室温下孵育30分钟

　　• 按照上述方法，用1000µl含1% BSA的PBS洗涤细胞两次

　　• 加入200µl抗CD31（鼠源），在室温下孵育30分钟

　　• 洗涤细胞两次

　　• 按照上述方法，用1000µl含1% BSA的PBS洗涤细胞，然后加入200µl甘油（80%的PBS溶液，添加2% DABCO）进行封片和防淬灭处理*。载玻片可保存约4周。

　　4. 固定、透化和封闭

　　• 在荧光显微镜下使用适当的滤光片组观察细胞，并可选择使用浸油。

　　HUVEC细胞；绿色：CD31（血小板内皮细胞黏附分子 - 1）；红色：VIII因子（vWF）；蓝色：细胞核DNA。（蔡司Axiovert 135; Plan-Neofluar 40x/0.75）