外分泌体含非编码RNA影响内皮细胞衰老和血管生成

内皮细胞，内皮祖细胞，基质细胞的信号在血管形成的时候是至关重要的。其中，外分泌体就是其中一种通信方式。有研究发现，外分泌体在免疫应答，肿瘤存活，应激反应和血管生成上的细胞间通信有着非常重要的作用。在外分泌体中有mRNA和miRNA往往会对受体细胞产生影响。荷兰的研究人员对外分泌体内的microRNA miR-214的研究发现，含有miR-214的外分泌体能够抑制受体细胞的内皮细胞的衰老，并且促进血管生成的发生。与此同时，其还会抑制毛细血管失调症突变体 ataxia angiectasia mutated (ATM)的表达。

研究人员采用毛细血管内皮细胞系（he human microvascular endothelial cell line (HMEC-1)），铺在基质胶上，采用添加/无外分泌体的培养基培养18小时，对比不同条件下的小管长度。

Endothelial cells require miR-214 to secrete exosomes that suppress senescence and induce angiogenesis in human and mouse endothelial cells

B. van Balkom, O. De Jong, M. Smits, J. Brummelman, K. den Ouden, P. de Bree, M. van Eijndhoven, D. Peg, W. Stoorvogel and T. Würdinger

Blood, 2013, 10.1182/blood-2013-02-478925

（一）实验材料和实验方法

1）细胞：  HMEC-1 (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA)    104 per well

2）培养基：      MCDB 131 Medium (Life Technologies)

3）基质胶：      Matrigel (ECMatrix, Millipore)                           10 µl per well

4）耗材：        µ-Slide Angiogenesis, ibiTreat (ibidi, 81506)                1 Slide

5）其他：        细格纸                                             1 sheet 

实验流程图：

实验流程图，提前将Matrigel融化，铺于ibidi血管生成载玻片 µSlide Angiogenesis 的下孔中，待胶凝后，将细胞悬液加入血管生成载玻片上孔中，成管后使用显微镜观察。

（二）实验步骤

1）准备基质胶

①　实验前一天将Matrigel置于冰盒中，放入4。C冰箱，使胶能过第二天缓慢融化。（注意：同样要准备一些4。C预冷的枪头用于吸取Matrigel）

②　开始实验前，将Matrigel始终保持放在冰盒中。

③　打开灭菌包装，取出ibidi血光生成载玻片 µ-Slide Angiogenesis。

④　每孔中加入10μl Matrigel。注意枪头要垂直于内孔的正上方加入Matrigel，防止有Matrigel流经上孔而留下残留胶。

怎么知道加了合适体积的Matrigel：
由于Matrigel流动性不强，并且有可能移液枪不准确，有可能10μl的胶不能填满ibidi血管生成载玻片的下孔，这样，必然会影响到实验的成像结果。这时用一张格子纸就能知道移液枪调整到多少能正好把下孔填满。

如上图所示，垂直透过每个孔看下面的格子纸，如果格子被缩小了，那么就说明胶没加满，格子被放大了，那么胶就加多了，格子没发生什么变形，这才是刚刚加满下孔的状态。

2）凝胶

①　盖上ibidi血管生成载玻片的盖子。

②　准备一个10cm的培养皿，放入浸过水的纸巾，制成一个湿盒。

③　将ibidi血管生成载玻片放入培养皿中，盖上培养皿盖。

④　将整个培养皿放入培养箱中，静置30分钟左右，等待胶凝结。

⑤　等待同时准备细胞悬液。

3）铺细胞

加入细胞的量直接影响实验结果，所以在正式实验开始之前，要对不同类型的细胞和使用数量进行预实验。获得佳比例的细胞密度。使用HMEC-1细胞，每孔种10000个细胞即可。

①　准备密度为2*105cells/ml的细胞悬液，充分混匀。

②　将胶已经凝固的ibidi血管生成载玻片从湿盒中取出。

③　每孔加入50μl的细胞悬液，注意保持枪头垂直在上孔的上方，不要接触下孔的凝胶。可以使用排枪。

④　同样用格子纸查看是不是加了足够量的液体，如果没有，加入无细胞的培养基，使上孔液体正好加满。

⑤　盖上盖，静置，一段时间后，所有细胞都会沉下去落在Matrigel的表面。

4）不同培养基处理

采用无处理基础培养基（basal,-），培养了HMEC-124小时后收集的培养基（cond,comp.）和在基础培养基中加入了分离出来的外分泌体的培养基（basal,+)分别加入血管生成载玻片中，37℃，培养18小时。

5）采集图像并统计结果

可以按照细胞的生长速度定时采集图像，并且对其成管长度测量和记录，并且对其进行统计分析。

三）实验结果

结果可见，18小时后，分别测量3组实验结果的血管长度，统计后发现，加入外分泌体的基础培养基和培养HMEC-1细胞24小时后收集的培养基的成管长度，显著长于纯的基础培养基中的HMEC-1细胞的成管长度。说明，外分泌体对血管生成有着显著的促进作用。