3D细胞培养--子宫内膜基质细胞eSCs和肿瘤血管内皮细胞

Eph和ephrin蛋白在协调细胞、细胞导向、细胞与细胞之间的相互作用中发挥着非常重要的作用，与发展的组织模式和器官和血管生成都有关系。Eph家族成员在人类肿瘤的发展过程中有着非常关键功能，在正常的子宫内膜的血管化再生组织和人子宫内膜具有多向分化潜能的间充质干细胞（EMSC）有能检测到Eph家族的蛋白表达，而其他高度血管化的人体器官却没有Eph的表达。澳大利亚的科学家发现，将EphA3+ or EphA3-depleted eSCs和tumour-derived endothelial cells (TECs)共培养时，EphA3+ eSCs不仅有更多的大细胞簇（15个细胞以上组成的）并且有更多的细胞簇。在添加 IIIA4这种Eph活化剂的时候，EphA3+ eSCs的细胞簇的数量有显著的降低。

Hypoxia-Controlled EphA3 Marks a Human Endometrium-Derived Multipotent Mesenchymal Stromal Cell that Supports Vascular Growth

C. To, R. Farnsworth, M. Vail, C. Chheang, C. Gargett, C. Murone, C. Llerena, A. Major, A. Scott and P. Janes

PloS one, 2014, 10.1371/journal.pone.0112106

（一）实验材料和实验方法

1）细胞：  EphA3+eMSCs                                 6 ×103cell/well

           EphA3-eSCs                                    6 ×103cell/well

           tumour-derived endothelial cells (TECs)         1.2 ×104cell/well

2）试剂：  5 mg/ml Alexa647 human/mouse chimeric (ch)IIIA4 antibody 

           Alexa647 human Fc as control （Jackson ImmunoResearch)

           5 mg/ml EphA3-Fc

           4% PFA/0.2% glutaraldehyde

           DAPI

3）基质胶：    Matrigel (ECMatrix, Millipore)                  10 µl per well

4）耗材：      µ-Slide Angiogenesis, ibiTreat (ibidi, 81506) 

5）仪器：      AF6000 LX microscope (Leica)    10x tile scan imaging 

6）其他：      细格纸                                             1 sheet 

1. 实验步骤

1. 准备基质胶

1. 实验前一天将Matrigel置于冰盒中，放入4。C冰箱，使胶能过第二天缓慢融化。（注意：同样要准备一些4。C预冷的枪头用于吸取Matrigel）

1. 开始实验前，将Matrigel始终保持放在冰盒中。
2. 打开灭菌包装，取出ibidi血光生成载玻片 µ-Slide Angiogenesis。

1. 每孔中加入10μl Matrigel。注意枪头要垂直于内孔的正上方加入Matrigel，防止有Matrigel流经上孔而留下残留胶。

怎么知道加了合适体积的Matrigel：

由于Matrigel流动性不强，并且有可能移液枪不准确，有可能10μl的胶不能填满ibidi血管生成载玻片的下孔，这样，必然会影响到实验的成像结果。这时用一张格子纸就能知道移液枪调整到多少能正好把下孔填满。

如上图所示，垂直透过每个孔看下面的格子纸，如果格子被缩小了，那么就说明胶没加满，格子被放大了，那么胶就加多了，格子没发生什么变形，这才是刚刚加满下孔的状态。

1. 凝胶

1. 盖上ibidi血管生成载玻片的盖子。
2. 准备一个10cm的培养皿，放入浸过水的纸巾，制成一个湿盒。
3. 将ibidi血管生成载玻片放入培养皿中，盖上培养皿盖。
4. 将整个培养皿放入培养箱中，静置30分钟左右，等待胶凝结。
5. 等待同时准备细胞悬液。

1. 铺细胞

• 按照1:2的比例准备EphA3+eMSCs或EphA3-eSCs与tumour-derived endothelial cells (TECs)混合的细胞悬液（6 ×103cell/well：1.2 ×104cell/well）
• 将胶已经凝固的ibidi血管生成载玻片从湿盒中取出。
• 每孔加入50μl的细胞悬液，注意保持枪头垂直在上孔的上方，不要接触下孔的凝胶。可以使用排枪。
• 盖上盖，静置，一段时间后，所有细胞都会沉下去落在Matrigel的表面。

1. 不同培养基处理

采用5 mg/ml Alexa647-IIIA4 antibody或Alexa647-Fc 或5 mg/ml EphA3-Fc或培养基分别加入血管生成载玻片中，37℃，培养多于18小时。

1. 采集图像并统计结果

采集图像并且统计细胞簇个数和细胞簇内细胞的个数。

1. 实验结果

如图所示，EphA3+ eMSCs细胞簇比EphA3-eSCs细胞簇更大，更多，并且内含15个细胞的细胞簇也越多。

当添加X-lkd IIIA4后，EphA3+ eMSCs细胞簇中大型细胞簇的比例有显著的下降。