免疫荧光实验iPSC-derive神经元的体外神经毒性检测

如今神经毒性检测主要是依赖活体动物实验，不仅有伦理问题，而且通常非常昂贵并且十分耗时。当需要大规模的测试化合物的时候就不太合适了。因此，高通量的体外的神经毒性测试就显得十分必要了，而且可以使用人源的细胞直接进行试验，试验结果的实用性也更佳。但是，到目前为止，人源干细胞诱导的神经元并没有适合进行这类试验的特质，试验时间较长，批次间差异大，并且有收到伦理和一些法律的制约，使得这种细胞都不太适用于做大规模的体外测试试验。近，市面上出现了商用的人源iPSC-derive神经元细胞，重复性好，可以用来做这类的体外神经毒性试验。

荷兰的科学家使用人源iPSC-derive神经元细胞做了免疫荧光染色试验，作为高通量进行体外的神经细胞毒性检测的预试验。由不同供应商提供的人源iPSC-derive神经元细胞混合培养能够形成不同（激活型或抑制型）神经元共培养的样本。

ALTEX. 2016 Mar 24. doi: 10.14573/altex.1510091

Is the time right for in vitro neurotoxicity testing using human iPSC-derived neurons?

Tukker AM1, de Groot MW1, Wijnolts FM1, Kasteel EE1, Hondebrink L2, Westerink RH1.

一、实验材料

1）细胞： iCell^® Neurons （NRC-100-010-001，Cellular Dynamics international）

          CDI iCell® Astrocytes（Cellular Dynamics international）

          HIP neurons (GSC-4312, MTI-GlobalStem)

          DOPA.4U® neurons (Axiogenesis, Cologne, Germany)    

2）培养基：Complete iCell Neurons Maintenance Medium (with 2% iCell Neurons Medium Supplement) supplemented with laminin (10 μg/mL)

3）试剂： Poly-L-Ornithine （[PLO] 0.01%）

4）培养耗材：µ-Slide 8孔腔室载玻片，ibiTreat底部处理 （ibidi，Germany，80826）

二、实验方法

一）载玻片包被

①　每孔加入300μl 的  0.01%的Poly-L-Ornithine 溶液

②　室温孵育60分钟

③　吸除所有液体并小心用PBS冲洗5-10分钟，即可开始使用

二）免疫荧光实验

1）铺细胞：

iCell^® Neurons 每孔铺100000个细胞

iCell® Neurons/CDI iCell® Astrocytes共培养，每孔铺66000个细胞

HIP neurons 每孔铺100000个细胞

DOPA.4U® neurons 每孔铺52000个细胞

DOPA.4U® neurons/iCell® Astrocytes共培养，每孔铺48000个细胞

2）加入约300μl/孔的4%多聚甲醛的PBS溶液，静置15分钟

3）加入300μl 1% Triton® X-100 的PBS 溶液通透3-5分钟

4）加入300μl 2% BSA的PBS溶液封闭20分钟

5）依次加入一抗，二抗进行免疫荧光染色后，冲洗小室并加入封片液进行显微镜观察（图二）。

图二：图示铺细胞，固定，清洗，染色步骤。

三、实验结果

图三：iPSC-derive神经元的免疫荧光染色结果。不同种类的人源iPSC-derive神经元使用β(III)tubulin（绿色）和GFAP（红色），用来区分神经元和星型胶质细胞（HIP® neurons, 左上；DOPA.4U® neurons，左下；iCell neurons，右上。） Human iCell 神经元用vGAT (绿色) 和vGluT (红色)确定抑制或激活突触（右下）。细胞核使用DAPI染色（蓝色）。