全内反射荧光显微实验TIRF实验

整合素是一种跨膜蛋白，在介导细胞黏附到细胞外基质（ECM）过程中发挥重要的作用。整合素在和配位体结合并发挥作用之前需要被激活。Kindlin和talin如何在非造血细胞中介入激活整合素这一过程的原理并不十分清晰。美国的科研人员发现缺少成纤维细胞，talin或kindlin都不能激活β1整合素，从而不能粘附到纤维粘联蛋白表面上；甚至不能由Mn2+介导的整合素粘连构象发生转变。使用Mn2+可以激活talin而不是kindlin缺陷细胞的部分整合素功能，使其活化和粘附在纤维粘连蛋白表面上。而具有方向性的粘附实际是由Kindlin直接诱导结合桩蛋白，可以反过来会粘附斑激酶（FAK）导致FAK活化并形成片状伪足。这一研究结果表明，talin和Kindlin协同激活整合素与纤维粘连蛋白的结合，并随后Kindlin会独自形成一个特别的信号位点，形成新的蛋白粘附位点。

本实验中，采用talin和kindlin正常细胞核缺陷细胞作为样本，对比各种细胞中整合素的分布，并且观测加入Mn2+后，细胞行为的变化着整合素的分布。不仅采用了免疫荧光的方法进行整合素的定位，并且在同一样本中使用TIRF技术，准确定位整合素的表达。

Elife. 2016 Jan 27;5:e10130. doi: 10.7554/eLife.10130.

Kindlin-2 cooperates with talin to activate integrins and induces cell spreading by directly binding paxillin.

Theodosiou M1, Widmaier M1, Böttcher RT1, Rognoni E1, Veelders M1, Bharadwaj M2, Lambacher A1, Austen K1, Müller DJ2, Zent R3,4, Fässler R1.

一、实验材料

1）细胞： Kind^ctr Cell （Kindlin正常对照细胞）

          Tln^ctr Cell  （talin正常对照细胞）

          Kind^ko Cell   (Kindlin缺陷细胞)

          Tln^ko Cell    (talin缺陷细胞)    

2）试剂： fibronectin（20 μg/ml, Calbiochem）

          4%多聚甲醛PBS溶液

          0.1% Triton X-100

          3%BSA

3）培养耗材：µ-Slide 8孔腔室载玻片，ibiTreat底部处理 （ibidi，Germany，80826）

二、实验方法

一）载玻片包被

①　每孔加入300μl 的  20 μg/ml的fibronectin溶液

②　室温孵育60分钟

③　吸除所有液体并小心用PBS冲洗5-10分钟，即可开始使用

二）免疫荧光实验

1）铺细胞，每孔铺约100000个细胞

2）加入约300μl/孔的4%多聚甲醛的PBS溶液，静置15分钟

3）加入300μl 1% Triton® X-100 的PBS 溶液通透3-5分钟

4）加入300μl 2% BSA的PBS溶液封闭20分钟

5）依次加入一抗，二抗进行免疫荧光染色后，冲洗小室并加入封片液进行显微镜观察（图二）。

图二：图示铺细胞，固定，清洗，染色步骤。

三、实验结果

图三：整合素在talin和kindlin缺陷细胞中的分布。A）共聚焦成像，显示细胞腹部的β1整合素（绿色）和F-actin（红色）在细胞中的分布。对比了有Mn²⁺存在或缺失的情况。B）共聚焦成像，显示细胞腹部的9EG7定位结果。C）TIRF成像，显示出β1整合素和柱蛋白的定位。D）TIRF-dSTORM采集的热图，显示出局部整合素的密度。