炎症应答和单核细胞的粘附实验之环境模拟

爱尔兰和瑞典科学家评估了一种抑制炎症和平滑肌细胞增殖的新的药物洗脱支架的治疗效率。在这项研究中，科学家用CX3CR1作为靶向受体，用于预防单核细胞的粘附和炎症反应。使用AZ12201182（AZ1220），一种CX3CR1的拮抗剂，处理单核细胞；并且在流体状态下，将AZ1220处理的单核细胞的在CX3CR1表面的粘附效率和没有任何处理单核细胞的粘附效率进行对比观测。更进一步，还研究了用AZ1220处理和没处理的单核细胞在内皮细胞表面的粘附效率。

Biomaterials. 2015 Nov;69:22-9. doi: 10.1016/j.biomaterials.2015.07.059. Epub 2015 Aug 3.

A novel CX3CR1 antagonist eluting stent reduces stenosis by targeting inflammation.

Ali MT1, Martin K1, Kumar AH1, Cavallin E2, Pierrou S3, Gleeson BM1, McPheat WL2, Turner EC1, Huang CL1, Khider W1, Vaughan C4, Caplice NM5.

一、实验准备实验材料及设备

1）细胞： Porcine peripheral blood monocytes               

2）试剂：Biocoll separating solution （Cat No. L6113, Biochrom,Germany）

         Monocyte Isolation Kit II   （Monocyte Isolation Kit II）

         100 nM CX3CL1 （Cat No. 365-FR-025, R&D Systems, USA）

         Cell Tracker Orange  (Cat no. C2927, Life Technologies)

         RPMI medium (Cat No. R7638, Sigma)

         lipopolysaccharide (Cat No. L2630, Sigma)  

3）培养耗材：ibidi六通道载玻片μ-Slide VI Luer （ibidi，Germany，80606）

             灌流管，15cm，1.6mm直径（ibidi，Germany，10962）

             封口夹

1. 仪器设备：ibidi流体剪切力系统，含空气泵（ibidi，Germany，10905）和流体单元（ibidi，Germany，10903）

二、实验方法

在实验开始前一天，请将所有需要使用的试剂，培养基，通道载玻片，灌流管都在37℃的二氧化碳培养箱中放置第二天，排除由于温度差产生的微量气泡。

一）滚动粘附实验设计：

• 用100 nM CX3CL1/或60000个/通道的内皮细胞预包被或预铺在6通道载玻片
• 六通道内细胞要使用lipopolysaccharide活化6小时
• 1×10⁵ cells/cm²密度的细胞（加入AZ1220，对照为不加入AZ1220）放入灌流管中
• 连接6通道载玻片到ibidi流体剪切力系统上，以0.5dyn/cm2 (50mPa) 开始实验。
• 15分钟在一个通道中不同位置采集5张图片，之后换通道再拍

二）搭建流体系统

1）将灌流管按照说明放在置在流体单元上。在灌流管的储液管中加入含细胞的12ml培养基。这时不需要连接通道载玻片。实验前需要去除整个灌流管中的气泡，存留在灌流系统的气泡会影响剪切力的大小，有时还会使灌流系统中的液体流动停滞。打开ibidi泵控制系统，在任务栏中找到“Remove air bubbles”，ibidi流体剪切力系统将自动运行下面任务，用于去除气泡。（表一）

2）连接通道载玻片（本次实验是用6通道载玻片，但每次实验只连接一个通道，所以这里使用单通道载玻片为例）。去除气泡后，就可以将之前准备好的含贴壁细胞的通道载玻片与灌流管相连。将搭载灌流管的流体单元从流体剪切力系统中取下，放到超净台中。将通道载玻片的注液孔用培养基装至过满状态(）。之后就按照下面的流程图连接通道载玻片（图一）。

图一：a）封口夹轻轻将灌流管的硅胶管夹住。b）将其中一个鲁尔接头从中间的链接管中拔出。c-j）按图示，将鲁尔接头与通道载玻片的注液孔相连，注意不能产生气泡，会有部分培养基溢出。k）连接好后，将封口夹移除，用无尘纸将溢出的培养基擦除。l）全部连接好后，用显微镜观测一下通道内的细胞状态。

3）检查灌流系统是否密封、是否将灌流管插入了正确的阀门。将封口夹夹住其中一根硅胶管，如果两边的灌流储液管液面不会下降或者上升，那么，整个系统就是密封的，并且是正确安装的（图二）。

图二

三 实验结果

如图所示：AZ1220在流体状态下抑制了单核细胞粘附CX3CL1。AB）在剪切力0.5dyn/cm2刺激下对比AZ1220的影响。流动15分钟后采集图片，并进行统计，单核细胞用 Cell Tracker Orange标记。CD）单核细胞在内皮细胞的粘附结果。两种粘附实验的结果均说明，随着AZ1220的浓度上升，单核细胞在CX3CL1的粘附性下降。