伤口愈合实验

伤口愈合实验--TARBP2的类泛素化（SUMOylated）调节miRNA/siRNA作用

小RNA介导的基因沉默对于基因表达转录前调节尤其重要，但是，如何调节miRNA/siRNA的作用机理还并未研究清楚。上海交大医学院的科研人员在2015年的NATURE COMMUNICATION上发的文章中研究调节miRNA/siRNA发挥作用的因子。研究表明，TARBP2的类泛素化（SUMOylated）不会对成熟的的miRNA的产物有左右，但是会影响miRNA/siRNA的效用。其会引入Ago2来形成RNA沉默聚合体，并且会介导表达更多的miRNA前体结合到这一复合体上，从而进一步介导RNAi。

伤口愈合实验是体外研究细胞迁移的一个有用的实验。原理是人为的在铺板的单层细胞中制造一个空白的无细胞的地带，然后对这个无细胞地带的边缘的细胞进行观察；这些边缘的细胞会开始进行迁移活动，并且终覆盖整个无细胞的区域，重新互相接触在一起。本研究中用到伤口愈合的实验，使用TARBP2和pri-miR130b共表达，通过对伤口愈合的速度的影响，得出TARBP2-K52R可以抑制pri-miR130b对伤口愈合过程的影响。

SUMOylation of TARBP2 regulates miRNA/siRNA efficiency.
Chen C, Zhu C, Huang J, Zhao X, Deng R, Zhang H, Dou J, Chen Q, Xu M, Yuan H, Wang Y, Yu J. 
Nat Commun. 2015 Nov 19;6:8899. doi: 10.1038/ncomms9899

在文中，使用Ibidi开发的伤口愈合插件进行了伤口愈合实验。这是一种双孔的硅胶插件，可以放在培养皿中，插件两孔间的孔壁宽度为500μm。将细胞种在插件中，等待细胞贴壁长满后，将插件移除，这样，两孔间的缝隙就是一个无细胞的“划痕”。

（一）实验材料
1)细胞:    serum starved A549luc stable cell line 
2)实验耗材:   伤口愈合插件培养皿 (ibidi, 81176) 
3)细胞培养基:  DMEM   （Hyclone） 
4)试剂:  Lipofectamine 2000 （Invitrogen）
5)灭菌镊子

（二）实验步骤
1）铺细胞（图三）
?将ibidi伤口愈合培养皿底部的保护胶带撕除。
?在ibidi细胞插件的每孔中加入5 × 103的细胞悬液。注意不要大力晃动培养皿。以防止细胞不均匀。
?在37。C培养箱中孵育24小时。

图三：A. 去除培养皿底部的保护胶带。B.C.在ibidi伤口愈合插件中加入细胞。

2）形成“划痕”
?采用无血清DMEM培养基培养细胞4小时
?如图四所示，小心的用镊子夹住插件的一个角，将插件移除。 
           
?移除插件后，要用显微镜检查是否形成合格的“划痕”。
?小心的清洗细胞，之后加入2ml培养基进行培养（图五）。

3）采集并分析图像
?在显微镜下选取能同时看到“划痕”和两边细胞的视野进行成像，“划痕”的方向好是水平或者垂直。
?采集0h和10h的图像，并且分析每张图的细胞覆盖划痕区的面积。

（三）实验结果

如图所示，共表达pri-miR130b和TARBP2-WT（miR130b-WT）比单独表达pri-miR130b（miR130b-con）对细胞迁移更有抑制作用，而将pri-miR130b和TARBP2-K52R（miR130b-K52R）共表达对于细胞迁移基本没有抑制作用了。